Extração Líquido vs. Extração Líquida Simplificada
por Allcrom | Phenomenex
O pré-tratamento da biomassa lignocelulósica é um pré-requisito para maximizar a liberação de glicose da celulose para posterior Fermentação ou Conversões Químicas. Um pré-tratamento principal envolve Ácido Diluído (por exemplo, 0,3 – 2% de Ácido Sulfúrico) em Temperaturas elevadas (140 a 200 °C) com diferentes Tempos de Retenção e cargas 1 de biomassa/Ácido. Uma desvantagem desse procedimento é a degradação parcial da lignina, uma Macromolécula Polifenólica para Fenólicos menores que são liberados junto com os Açúcares no chamado Hidrolisado. Esses compostos Fenólicos são tóxicos para microrganismos e são potenciais Inibidores de Fermentação 2-5.
A Análise desse perfil Fenólico é importante ao otimizar os Métodos de pré-tratamento ou desintoxicação com o objetivo de minimizar os Níveis de Inibidores ou desenvolver microrganismos mais Resistentes. Em uma Etapa de Preparação e limpeza de Amostras amplamente empregada, os Compostos Fenólicos passam por uma Extração Líquido-Líquido usando um Solvente Orgânico (por exemplo, Acetato de Etila) e são então Analisados via GC/MS6.
Embora Eficaz, a Extração Líquido-Líquido pode ser demorada, exigindo 4 Extrações Separadas e várias Etapas de Centrifugação. Em uma tentativa para reduzir o Tempo e as Etapas de manuseio de Amostras, uma Extração Líquida Simplificada (SLE) usando Novum SLE foi empregada, economizando uma quantidade significativa de Tempo e reduzindo a quantidade de Etapas necessárias de Pipetagem e manuseio de Frascos.
Materiais e Métodos
A Biomassa Lignocelulósica foi Preparada usando dois Métodos diferentes, uma Extração Líquido-Líquido tradicional e uma Extração Líquida Simplificada (SLE) usando uma placa Novum SLE MAX de 96 poços (Referência: 8E-S138-5GA). Antes de cada Método de Extração, as Amostras foram pré-tratadas da seguinte forma:
Pré-tratamento
Um pré-tratamento do Hidrolisado com Ácido Diluído (1,5% de Ácido Sulfúrico, 190 °C por 1 minuto, 25% de carga de biomassa) de Miscanthus X giganteus foi Filtrado usando uma membrana de PES (Polietersulfona) Filtro de 0,45 µm e foi enriquecido com 20 µg/mL de Isopropilfenol como Padrão interno (PI). As Amostras pré-tratadas foram então Extraídas por Extração Líquido-Líquido ou SLE (abaixo).
Procedimento de Extração Líquido-Líquido
Na etapa de pré-tratamento alíquotas de 1 mL do Hidrolisado enriquecido foram extraídos 4x cada com 0,5 mL de Acetato de Etila. Após cada Extração, uma Etapa de Centrifugação (1500 g por 1 minuto) foi aplicada para Separação de Fases. Os Extratos combinados de cada Amostra foram Secos sobre Sulfato de Sódio6 (amostras A).
Procedimento de Extração de Líquido Simplificado (SLE)
Alíquotas de 400 µL do Hidrolisado enriquecido na etapa de pré-tratamento foram carregadas nos poços de uma placa de 96 poços Novum SLE MAX. A Amostra foi deixada de molho no Sorvente por 5 minutos e então o Acetato de Etila foi aplicado para Eluir os Analitos de interesse. Três Volumes diferentes foram aplicados para determinar o Volume de Eluição mais Eficiente. Foram aplicados 1x 0,4 mL (Amostras B), 1x 0,8 mL (Amostras C) ou 2x 0,4 mL (Amostras D) de Acetato de Etila usando um pulso curto de Vácuo. Nenhuma Secagem adicional de Acetato de Etila foi realizada após a Eluição. Condições GC/MS
Resultados e Discussão
A Figura 1 mostra as recuperações Relativas de 25 Compostos Fenólicos selecionados do Hidrolisado Eluído da placa de 96 poços Novum SLE MAX usando os procedimentos 3 de Eluição (0,4 mL, 0,8 mL e 2 x 0,4 mL) em comparação com os valores obtidos pelo Líquido-Líquido convencional Extração (=100% no gráfico representativo).
No geral, a Extração do Novum SLE produziu recuperações comparáveis ao procedimento tradicional de Extração Líquido-Líquido em uma Fração do Tempo (uma diminuição de cinco vezes na quantidade de Tempo de Preparação da Amostra). A Eluição de 0,4 mL de Acetato de Etila resultou em uma recuperação geral mais baixa dos Analitos em comparação com as Extrações de 0,8 mL e 2 x 0,4 mL de volume. As exceções foram 4-Hidroxi-3-Metoxi-Cinamaldeído (Figura 1, Analito 9) com níveis de recuperação quase idênticos observados (95% e 93%, respectivamente) para todos os volumes de Eluição e sinapaldeído (Figura 1, Analito 12) com uma recuperação maior para o Volume de Extração de 0,4 mL (93%) em comparação com os outros Volumes de Extração aplicados (89% e 85%, respectivamente). No entanto, um Volume de Extração de 0,4 mL foi geralmente considerado abaixo do ideal. Aumentar o Volume de Eluição para 0,8 mL melhorou a recuperação com a maioria das recuperações atingindo >90%. Rendimentos ligeiramente inferiores foram observados para 4-Hidroxibenzaldeído (87%) (Figura 1, analito 1) e Vanilina (89%) (Figura 1, Analito 2). Apenas os Homólogos 2-guaiacil acetaldeído (Figura 1, Analito 14) e 2-siring acetaldeído (Figura 1, Analito 16) exibiram níveis de recuperação mais baixos de 75-76% e 73-75%, respectivamente. A aplicação do Volume de Eluição de 0,8 mL em duas Etapas (2 x 0,4 mL) não melhorou a recuperação em comparação com uma única Alíquota de 0,8 mL. TN-0082 Página 2 de 4 APLICAÇÕES
Conclusão
Ao Extrair 0,4 mL de um Hidrolisado de planta Diluído em ácido usando uma placa de 96 poços Novum™ SLE MAX, um Volume de Eluição de 0,8 mL de Acetato de Etila resultou em altas recuperações de > 90% para a maioria dos Analitos Fenólicos. Não foi necessário secar mais a fase de acetato de etila para garantir uma derivatização bem sucedida na posterior análise em GC/MS. Em comparação com a Extração Líquido-Líquido convencional, estimamos uma redução de até cinco vezes no Tempo de Preparação da Amostra.
Além disso, a Extração do Novum SLE também simplifica bastante a Preparação da Amostra, reduzindo a quantidade de Pipetagem necessária e as Etapas de manuseio de Frascos. Portanto, a Preparação da Amostra usando o Novum SLE resultou em um perfil de Inibidor Fenólico muito semelhante e comparável à Extração Líquido-Líquido convencional, mas em uma fração do tempo e trabalho.