Medição de Esteróides em Doping Esportivo Usando VAMS -

Medição de Esteróides em Doping Esportivo Usando VAMS^®:

Um artigo de Alan D. Brailsford e WC Chang, et al, no Drug Control Center e duas outras Instituições, publicado em agosto de 2020 no Journal of Chromatography A, descreveu o desenvolvimento de um estudo rápido de GC-MS/MS para medir esteroides anabólicos androgênicos dos Dispositivos de Microamostragem Mitra® baseados na Tecnologia VAMS®. O artigo é intitulado “Determinação de esteroides anabolizantes em sangue seco usando microamostragem e espectrometria de massa em tandem por cromatografia gasosa: Aplicação a um estudo de administração de gel de testosterona”.

O estudo se concentrou em medir simultaneamente nove esteroides anabólicos androgênicos em 6,4 minutos e depois aplicar esse método a amostras VAMS®. As amostras foram coletadas de voluntários atletas para medir a detecção de um gel de testosterona. Os autores concluíram que o Dispositivo VAMS® poderia ser empregado para quantificar o nível de T [testosterona] no sangue de acordo com o uso da amostra de soro.

Doping Esportivo e Agência Mundial Antidoping

A Agência Mundial Antidoping (WADA) foi formada em 1999 após um grande escândalo de doping atingir o mundo do ciclismo competitivo em 1998. Desde a formação da WADA, a lista de substâncias proibidas em esportes competitivos se expandiu para incluir hormônios peptídicos e substâncias relacionadas, beta-2-agonistas, moduladores hormonais e metabólicos, diuréticos e ingredientes mascarantes, estimulantes, canabinoides narcóticos, EPO (eritropoietina) e glicocorticóides.

A classe mais famosa de substâncias proibidas são os agentes anabolizantes, onde a grande maioria são esteroides anabólicos androgênicos (EAAs). De acordo com um relatório da WADA publicado em 2018, o uso indevido de EAAs é responsável por 44% dos achados analíticos adversos. Embora os EAAs atuem para melhorar o desempenho, eles também podem causar problemas de saúde a longo prazo para quem os toma. De fato, eles podem afetar adversamente muitas áreas do corpo, potencialmente causando danos ao sistema cardiovascular, sistema hormonal, fígado (por exemplo, formação de tumor) e sistema musculoesquelético. O uso indevido de EAAs também pode causar efeitos psiquiátricos, como agressividade, infecções como o HIV pelo uso de agulhas compartilhadas e problemas de pele, como acne grave.

Monitoramento de Doping com Esteroides Androgênicos

Na tentativa de evitar a detecção, alguns indivíduos em uso de doping usam regimes de microdosagem em que tomam doses menores de esteroides e outras substâncias proibidas que tornam a detecção mais desafiadora. Uma estratégia de microdosagem é empregar doping transdérmico, como a aplicação de géis hormonais. Para laboratórios que tentam detectar efetivamente substâncias proibidas, sangue total, soro ou plasma são as matrizes preferidas para análise quantitativa. Estas são consideradas as melhores matrizes para correlação com as respostas fisiológicas. No entanto, a coleta tradicional de sangue venoso com agulhas é invasiva e exige que a coleta seja realizada por mão de obra especializada.

Por outro lado, a amostragem de urina não é invasiva e pode ser realizada através da autocoleta. Por essas razões, a urina é atualmente o método mais popular para coleta de amostras em testes de doping esportivo. No entanto, a coleta de urina apresenta seus próprios desafios. Como um agente oficial precisa estar presente durante a coleta de amostras, os atletas consideram o processo pessoalmente intrusivo. A coleta de urina também é demorada e pode ser um desafio armazenar com eficiência grandes volumes de amostras líquidas.

De acordo com o artigo do estudo de Brailsford e Chang, et al., revisado aqui, as gotas de sangue seco (DBS) oferecem uma solução potencial para superar os desafios da amostragem de sangue venoso e da amostragem de urina. No entanto, os papeis-filtro tradicionais também apresentam alguns problemas relacionados à qualidade da amostra e ao efeito volumétrico associado ao hematócrito que limitam seu uso na triagem antidoping. Os autores do estudo relatam em trabalhos anteriores que as recuperações de extração de esteroides em gotas de sangue seco são baixas (~ 20%). Devido às limitações do papel-filtro, o grupo de pesquisa optou por desenvolver um método com os Dispositivos Mitra-VAMS® pois estes resolvem muitas das desvantagens observadas com o papel-filtro.

Métodos e Resultados do Estudo de Doping Esportivo

Os seguintes esteroides foram usados para o estudo: testosterona, nandrolona, boldenona, mesterolona, drostanolona, metenolona, metandienona, oxandrolona e DHCMT.
Foi desenvolvido um GC-MS/MS rápido, que melhorou o rendimento dos métodos anteriores. De fato, todos os nove alvos foram identificados com sucesso em menos de 6,4 minutos.
Para controle, preparou-se sangue sem esteroides lavando as células sanguíneas e introduzindo-as no plasma sem esteroides.
A extração das pontas VAMS® de 20 µL empregou uma técnica de extração líquido-líquido, usando uma mistura de água e MTBE usando ultrassom, mistura rotativa e centrifugação.
- A maioria dos analitos passou em precisão e exatidão, exceto para drostanolona (23,1% DPR no nível baixo) e DHCMT (2,25% DPR no nível alto) com a precisão sendo medida ao longo do dia.
- Todos os analitos fornecem curvas de calibração de r2 = >0,999 dentro das faixas de concentração com vieses aceitáveis.
- O método pode medir T de forma confidencial em homens saudáveis (intervalo plasmático = 2,8-13,2 ng mL-1), mas não foi sensível o suficiente para medir níveis femininos normais (intervalo plasmático = 0,1-07 ng mL-1).
- As recuperações de extração ficaram entre 43% e 89%.
- A comparação de soro úmido com sangue úmido seco foi realizada a partir de 40 amostras de sangue venoso. Usando valores de hematócrito, o grupo foi capaz de ajustar para a porção de hematócrito. Uma boa concordância foi demonstrada pela regressão de Deming e análise de Bland-Altman, de modo que o grupo concluiu que os extratos de VAMS® eram tão adequados quanto o soro para a determinação de T.
Voluntários saudáveis do sexo masculino foram escolhidos para realizar o ensaio. Eles foram analisados para garantir que não estavam participando de eventos esportivos competitivos (ou piscinas de teste), não estavam tomando nenhuma substância e não tinham nenhuma condição de saúde que pudesse afetar os resultados do estudo.
As coortes foram divididas em 3 grupos e, em seguida, o sangue capilar foi coletado usando dispositivos Mitra® com pontas VAMS® de 20 µL.
Os voluntários do estudo coletaram amostras em 6 pontos de tempo (0, 9, 24, 48, 72 e 96 horas). Os voluntários podiam participar várias vezes em mais de uma coorte, desde que houvesse uma semana de intervalo entre os testes.
- Grupo 1 – Uma dose de gel placebo (n = 7)
  - - As amostras estavam em níveis normais de T (<30 ng mL-1).
- Grupo 2 – Uma dose de gel de testosterona (Tostran®) (50 mg, n=7)
  - - O pico T foi às 9h (média Cmax = 91,2 ng mL−1), embora alguns mal atingissem 30 ng mL-1 neste momento, o que mostrou uma alta variabilidade intersujeitos. Concluiu-se que isso pode ser devido a diferenças na taxa de absorção e metabolismo de indivíduo para indivíduo.
- Grupo 3- Uma dose de gel Tostran® (100 mg, n=7)
  - - O pico T também foi às 9h (média Cmax = (234,9 ng mL−1). Além disso, alguns indivíduos não retornaram totalmente à linha de base, mesmo após 96h. Se um ponto de corte de 30 ng mL−1 fosse aplicado, uma janela de detecção poderia ser de até 48h após a dosagem.

Conclusões dos Autores do Estudo

O estudo validou uma abordagem confiável e promissora para medir 9 EAAs de amostras VAMS^®.
O novo método GC-MS/MS detecta rapidamente (tempo de execução de 6,4 min) tão baixo quanto 0,10 ng mL−1 em amostras de 20 μL VAMS^®.
As recuperações de extração VAMS^®são superiores ao papel-filtro.
Boa concordância observada entre as amostras de soro e VAMS^®.
O método é sensível para medir a microdosagem de testosterona pseudo endógena.
O ensaio está sendo expandido para um grande estudo de coorte.

Comentários Neoteryx

Em 2021, o comitê executivo da WADA aprovou um documento técnico para o emprego de testes inovadores de gota de sangue seco nos esportes. Este foi o resultado do documento técnico da WADA, que foi baseado nas descobertas de vários estudos que descobriram que o sangue seco pode detectar doping, a WADA aprovou o método para uso preliminar nas Olimpíadas de Tóquio.

Conforme evidenciado pelo artigo revisado aqui, a natureza quantitativa dos dispositivos Mitra^® com Tecnologia VAMS^® e sua facilidade de uso em comparação com o papel-filtro, bem como sua excelente recuperação de extração demonstram sua aplicabilidade em testes de doping esportivos. Um estudo relacionado que analisamos em um blog recente mostra que VAMS^® não é apenas adequado para análise de moléculas pequenas, mas também para moléculas grandes, como DNA transgênico no doping esportivo.

Este artigo foi resumido para nossos leitores por James Rudge, PhD, Diretor Técnico da Neoteryx. Este é um conteúdo com curadoria. Para saber mais sobre a importante pesquisa descrita neste blog, visite o artigo original no Journal of Chromatography A.
Créditos de imagem: iStock, Neoteryx, Trajan Scientific and Medical

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