Monitoramento Terapêutico de Metotrexato em Microamostras de Sangue Total
por Allcrom
Um artigo de Dala N. Daraghmeh e outros pesquisadores na Austrália, publicado na edição de julho de 2022 da Analytical and Bioanalytical Chemistry, relatou uma investigação sobre níveis relativos de Metotrexato e Poliglutamato Metotrexato em diferentes matrizes sanguíneas.
O artigo é intitulado “Quantificação de Poliglutamatos de Metotrexato em sangue total humano, Eritrócitos e Leucócitos coletados por punção venosa e microamostragem volumétrica absorvente: um método verde baseado em LC-MS/MS.” Ele descreve uma investigação completa sobre a possibilidade de usar amostragem de sangue total em vez de plasma ou hemácias lavadas para o monitoramento terapêutico (TDM) remoto de Metotrexato.
O que é o Metotrexato?
Em 1948, Sidney Farber relatou o uso de Aminopterina, um derivado Amino do Àcido Fólico, como um agente Antineoplásico para o tratamento de Leucemia Pediátrica. Durante os anos seguintes, percebeu-se que o medicamento levou a uma interferência na proliferação do tecido conjuntivo. Em 1951, um estudo mostrou melhorias em pacientes com artrite Reumatoide (AR), Psoríase e Artrite Psoriática (AP) quando receberam Aminopterina. Devido a problemas de fabricação, o fármaco foi posteriormente modificado com a adição de um grupo Metil.
O medicamento resultante, Metotrexato (MTX), foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA em 1953 para o tratamento de uma série de condições, incluindo Leucemia
Linfoblástica aguda (em combinação com outras terapias). Vários estudos realizados nos anos seguintes também mostraram resultados positivos para aqueles que sofrem de AR e AP.
Como resultado, na década de 1980, houve uma absorção generalizada no uso de Metotrexato para o tratamento de doenças como a AR. Existem vários mecanismos de ação propostos para o Metrotexato, incluindo a inibição de várias enzimas, como a Metilenotetrahidrofolato redutase, que pode levar a uma interferência na síntese de DNA.
Pesquisando o monitoramento aprimorado do Metotrexato
- O grupo desenvolveu e validou com sucesso um HILIC LC-MS/MS de alta sensibilidade para todas as matrizes testadas (de acordo com as diretrizes da FDA).
- O grupo isolou PBMC, hemácias e plasma para extração e análise; sangue total úmido e seco (20 µL de Mitra®) também foi extraído e analisado.
- As avaliações de ecologização para cada método foram pontuadas usando o “Procedimento Analítico Verde” e uma ferramenta de Abordagem Métrica Analítica da GREENNESS (AGREE).
- As amostras de Mitra-VAMS® foram estáveis a 37°C e temperatura ambiente por duas semanas. As amostras de sangue total permaneceram estáveis a temperatura ambiente por 24h.
Ao comparar MTX-PGs em amostras de pacientes em diferentes pontos de tempo, verificou-se que a distribuição era diferente em hemácias em comparação com PBMCs. Isto foi devido, em parte, a presença e ausência de certas Proteínas celulares como Fator de Replicação C (RFC) Gama Glutamil Hidrolase (GGH) e Formamidopirimidina-Glicosilase (FPG) que estão envolvidas com o transporte de MTX dentro e fora das células. Estas proteínas não estão presentes em hemácias maduras, mas são encontradas em PBMCs.
O grupo concluiu que a concentração de MTX-PGs em PBMCs provavelmente seria mais dinâmica em comparação com hemácias. Curiosamente, as hemácias imaturas contêm a Proteína RFC (que está envolvida na absorção de MTX no espaço intracelular). - A equipe então avaliou a distribuição de MTX-PGs individuais e as concentrações médias destes em: hemácias lavadas, plasma, sangue total úmido e amostras de Mitra-VAMS® capilares secas.
- Eles descobriram que, para o plasma, apenas MTX-PG1 e MTX-PG-2 foram detectáveis, no entanto, todos os 5MTX-PGs (MTX-PG1-5) foram vistos nas outras matrizes testadas.
- A concentração total de MTX-PG em hemácias lavadas foi então comparada com sangue total úmido e VAMS. A razão média das concentrações calculadas de 0,91-1,0 foi observada para hemácias: sangue total, sangue total: VAMS e RBC: VAMS.
- Foi observado na dosagem inicial que o progenitor de MTX seria artificialmente maior em amostras de sangue total/VAMS®, em comparação com hemácias lavadas. Isto foi devido à liberação incompleta do progenitor MTX na fração plasmática após a dosagem inicial.
- Dessa forma, o grupo concluiu que isso limitaria a coleta para TDM nessas matrizes para pouco antes de uma nova dosagem, em vez de logo após a dosagem, uma vez que as matrizes de sangue total continham plasma e células.
- Em termos de “classificação verde” para cada método, VAMS® foi considerado o mais verde com “pontuações AGREE” de 0,68 em comparação com 0,61 para o método utilizando hemácias.
Métodos e Resultados do Estudo ‘Químicos Eternos’
- 45 produtos químicos PFAS foram direcionados para o ensaio; 21 destes foram detectados em 1 ou mais amostras.
As amostras foram então extraídas e analisadas por um novo método LC-MS/MS de alta sensibilidade.
- Foram utilizados Dispositivos Mitra® com 4 amostradores de 30 µL por evento de coleta para reunir um volume maior. Esperava-se que isso atuasse para mitigar a contaminação de fundo nominal; as amostras extras também poderiam ser usadas para reanálise, se necessário.
- A precisão e a exatidão do evento de coleta foram determinadas gravimetricamente e verificou-se que estavam dentro de >98% das reivindicações dos fabricantes com 5% de DPR das amostras.
- Amostras venosas (ambas de soro e sangue total seco em VAMS®) foram coletadas de 60 participantes, de uma região onde a água estava contaminada com produtos químicos PFAS. A partir desta coorte, 53 indivíduos também forneceram sangue capilar autocoletado usando dispositivos Mitra®.
- 54% das amostras VAMS® pareadas, coletadas das amostras venosas (por tubo de sangue) ou das amostras autocoletadas, foram secas com dessecante e armazenadas a -20 °C. O restante foi armazenado à temperatura ambiente durante 48 horas antes de ser congelado a -20 °C.
- A detecção de PFAS e as abundâncias em Mitra® foram comparáveis a população em geral.
- Todos, exceto NEtFOSAA e PFDoA, foram detectados no sangue total; suas frequências de detecção foram de apenas 2,4% no soro.
- A frequência de detecção de PFNA foi 15-20% menor nas amostras VAMS®.
- O FOSA não foi detectado no soro, mas teve quase uma frequência de detecção de 50% em VAMS®, o grupo hipotetizou que isso se particionou na camada buffy.
- A correlação de Spearman foi muito alta para todos os tipos de amostra (r > 0,93 e p < 0,0001), incluindo amostras que foram armazenadas a temperatura ambiente por 48 horas.
- As concentrações no sangue total foram principalmente maiores no soro (1,53-1,99) devido ao particionamento do sangue para o plasma.
- Os dados de sangue venoso a capilar foram altamente correlacionados para a maioria dos PFASs (0,97-1,19).
- Os gráficos de dispersão mostraram altas correlações para todos os tipos de amostra (r ≥ 0,92); essas correlações foram observadas para os PFAS mais abundantes.
- A abordagem de microamostragem de sangue capilar mostrou ~100% de recuperação em <6% de DPR em comparação com <3% de DPR para soro.
- Os limites de detecção convertidos no soro foram de 0,1 a 1,0 ng/µL; estudos futuros precisariam ser realizados para observar níveis mais baixos na população.
Conclusões dos autores do estudo
- Tradicionalmente, as hemácias têm sido usadas como substitutas para PBMCs (que se acredita ser o local de ação do MTX), mas o grupo viu diferenças entre as duas matrizes e precisaria realizar mais trabalhos para entender estas implicações.
- Eles relataram que a coleta de microamostras Mitra-VAMS® provou ser um método muito simplificado e barato. Relataram que o método de microamostragem capilar economiza tempo e que VAMS® é ideal para o automonitoramento, bem como para aumentar a autoconsciência dos medicamentos. Comentaram que isso permitiria uma abordagem colaborativa para o atendimento entre médico e paciente.
- Deve-se notar que as amostras devem ser coletadas antes da próxima dose de MTX para medição de sangue total, em comparação com células brancas lavadas.
- Compreender o acúmulo de Metabólitos em diferentes frações do sangue tem o potencial de gerar clareza quanto a farmacocinética do MTX para permitir modificações na dose do medicamento administrada.
Comentários
A realização de estudos de comparativos entre extratos VAMS® versus processamento de plasma tradicional é sempre recomendada para entender se vieses relacionados são vistos. No entanto, a distribuição de medicamentos e/ou metabólitos também pode ser diferente, dependendo do local de ação. Este estudo ilustra a importância de conhecer a natureza farmacodinâmica do medicamento e dos metabólitos, especialmente quando o alvo da droga é encontrado no sangue.
Este é um conteúdo com curadoria.
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