Análise de Aflatoxina B1-lisina para estudos de Saúde Pública
por Allcrom
Um artigo de JB Renaud, JP Walsh e MW Sumarah, em duas instituições no Canadá, foi publicado na edição de setembro de 2022 da Toxins. O grupo de pesquisa desenvolveu um material de referência para monitorar a exposição crônica à aflatoxina B1, um carcinógeno produzido por algumas espécies de mofo, que pode causar câncer de fígado. O artigo foi intitulado “Otimização da análise de aflatoxina B1-lisina
para estudos de exposição em saúde pública”.
Seu estudo mostrou a importância de avaliar minuciosamente o desempenho da síntese de um material de referência eficaz. O estudo também mostrou que, em comparação com o soro líquido, eles poderiam alcançar os mesmos resultados analíticos ao extrair soro seco de Dispositivos de Microamostragem Mitra® com base na tecnologia VAMS®. A abordagem de microamostragem volumétrica absorvente potencialmente supera o desafio do transporte caro em cadeia fria, necessário com amostras líquidas.
Em março de 2022, relatamos um estudo publicado por pesquisadores da Universidade de Ghent sobre a medição de 24 Micotoxinas de microamostras de sangue seco Mitra®. Este estudo demonstrou estabilidade da amostra no Dispositivo de Microamostragem Mitra®, mesmo quando comparado com amostras de sangue líquido. Nenhum caso de exposição a Micotoxinas foi perdido ao testar 20 microamostras de sangue seco. De fato, os autores do estudo afirmaram: “A amostragem VAMS® pode servir como uma excelente alternativa à amostragem venosa convencional para realizar uma triagem quantitativa da exposição à Micotoxinas”.
As Aflatoxinas são produzidas por moldes de Aspergillus e são Hepatotoxinas de ocorrência natural que crescem em muitas culturas alimentares, incluindo grãos, sementes e amendoim. A Aflatoxina de maior preocupação é a Aflatoxina B1 (AFB1). Isso ocorre porque esta
é a toxina mais dominante relacionada ao aumento do risco de desenvolver câncer de fígado entre indivíduos cronicamente expostos ao mutagênico.
A causa da mutagenicidade de AFB1 é bem compreendida. Ironicamente, é devido à ação de desintoxicação natural pelo sistema Citocromo P450 no fígado, levando a uma fração Epóxido instável da toxina. Esta fração de Epóxido então reage com frações de Guanidina em moléculas de DNA e, como resultado, inter-quela com o DNA, o que leva a eventos de mutação.
Além de se ligar ao DNA, o Epóxido AFB1, que hidrolisa prontamente a um Dialdeído, liga-se covalentemente a frações de Lisina em Proteínas. Por exemplo, acredita-se que AFB1 reage especificamente com dois resíduos de Lisina específicos na Albumina de soro humano (HSA) e, como resultado, pode ser explorado como um biomarcador para estudos de exposição crônica da toxina.
A natureza específica do biomarcador é o Aduto de Lisina (AFB1-Lys), que é liberado por atividade proteolítica enzimática ex vivo usando Pronase (uma mistura de Proteases) no evento de preparação da amostra.
Uma das técnicas analíticas mais populares para análise de AFB1-Lis é LC-MS/MS. Deve-se notar que existem vários desafios para garantir que ensaios confiáveis sejam desenvolvidos. O primeiro desafio é garantir que a limpeza da amostra seja suficientemente eficaz para que a supressão / intensificação de Íons (SSE%) seja minimizada.
Outro desafio é a necessidade de padrões analíticos eficazes. Finalmente, o transporte em cadeia fria de amostras de Proteínas (amostras de sangue) pode ser proibitivo em termos de custo, portanto, métodos alternativos para transporte e armazenamento mais baratos e simples estão em demanda.
A solução para o desafio de envio é usar microamostras de matriz seca onde certas Proteínas demonstraram permanecer estáveis durante o armazenamento e transporte sem a necessidade de congelamento. Por exemplo, foi demonstrado que os Anticorpos Monoclonais (MAbs) mostram bons graus de estabilidade em microamostras Mitra® secas em várias temperaturas, incluindo em temperatura ambiente.
Foram esses desafios que motivaram Renaud e outros pesquisadores a desenvolverem um material de referência de Albumina de Soro AFB1 (SA) e comparar os resultados do uso deste SA em microamostras de matriz seca comparadas ao soro líquido.
Conquistas do Estudo de Aflatoxina B1-Lisina
- Os pesquisadores sintetizaram um AFB1-8,9-epóxido usando Dimetildioxirano, que eles então usaram para ligar covalentemente com sucesso o Epóxido aos resíduos de Lisina em HAS.
- Para obter um padrão AFB1-Lys, a HSA derivatizada foi digerida com Pronase. Para entender as condições ideais de digestão, várias condições foram exploradas. Estes foram delimitados usando dois padrões internos marcados isotopicamente internos:
- Para monitorar a estabilidade padrão, um padrão foi adicionado no início da digestão.
- Para monitorar o impacto da porcentagem de SSE no LCMS, um segundo padrão foi adicionado após a digestão.
- O grupo descobriu que a digestão usando uma razão de Pronase para HSA de 1:5 em menos de 4 horas foi o melhor compromisso entre a digestão e os efeitos da matriz. Além disso, elevar a temperatura de digestão de 37°C para 50°C também ajudou na eficiência da digestão.
- Ao comparar os efeitos do tampão, solução Salina tamponada com Fosfato, tampão Tris e Bicarbonato de Amônio 50 mM, eles descobriram que todos os três deram eficiência de digestão semelhante, mas tanto o Tris quanto o Bicarbonato de Amônio deram a menor porcentagem de SSE.
- Tradicionalmente, o Aduto AFB1-Lys foi normalizado pela quantidade de HSA no soro. No entanto, evidências recentes sugerem que o Aduto é mais efetivamente normalizado por volume.
- O grupo queria comparar VAMS® e Cartões DBS. Ao fazer isso, eles descobriram que a única maneira de controlar o volume no cartão DBS seria pipetar um volume exato. Eles decidiram que o método de coleta quantitativa oferecido pelos dispositivos Mitra® baseados na Tecnologia VAMS® poderia ser usado em vez do cartão DBS, pois isso, no futuro, negaria a necessidade de pipetar um volume exato de soro.
- Ao comparar os extratos de VAMS® com o soro, nenhuma diferença foi observada, enquanto uma supressão significativa de sinal foi observada nas amostras de cartão DBS.
Conclusões do Autor do Estudo de Aflatoxina B1-Lisina
Os autores do estudo foram capazes de criar e caracterizar um material de referência de Albumina Sérica de Aduto AFB1-Lis para ser usado no desenvolvimento e validação do método. Mesmo que os Dispositivos Mitra® tenham se mostrado promissores, os pesquisadores determinaram que eles precisavam de um volume de amostra de cerca de 100 µL, que era mais volume do que as pontas VAMS® de 20 µL nos dispositivos Mitra® fornecidos. Os autores relatam que planejam usar o método para comparações interlaboratoriais.