Realizando o desenvolvimento de um método HPLC

Ao contrário da crença popular, a Cromatografia por Exclusão de Tamanho, (SEC), não é simples. Entretanto, deveria ser – é uma separação não Absortiva, certo? Basta procurar a Curva de Calibração de uma coluna SEC, usar uma Fase Móvel padrão como 1X PBS, e voila, trabalho feito.

Claro, esse não é o caso. Para uma verdadeira separação “SEC ideal”, a separação deve ser completamente “Entrópica.” O que isso significa? Para separar os Analitos pelo seu volume Hidrodinâmico, as interações eletrostáticas e Hidrofóbicas devem ser minimizadas. Essas interações secundárias são fontes de Alargamento da Banda e má formação de pico que podem afetar drasticamente a técnica que já é caracteristicamente de baixa resolução. Essas interações secundárias também podem ser fortes o suficiente para afetar a recuperação de proteínas. E a maioria dos métodos de SEC, especialmente para análise de proteínas e agregados, são quantitativos. Portanto, a recuperação do agregado em um método SEC pode ser um pouco preocupante.

Os anticorpos monoclonais (mAbs) são uma situação especial, pois a redução das interações secundárias, Troca Iônica e hidrofóbica, é uma tarefa difícil. mAbs são relativamente grandes (~150kD), então seus agregados são gigantescos. Então, você pode imaginar, mAb agregado (ou seja, monômeros de mAb aglomerados) podem se tornar muito hidrofóbicos. Além disso, dependendo da sequência, os mAbs podem ser fortemente carregados – especialmente sob pH fisiológico. Panitumumabe e Palivizumabe, por exemplo, ambos têm pontos isoelétricos maiores que 9, portanto, interações de Troca Iônica secundárias são esperadas com pHs tão altos.

Desta forma, o desenvolvimento de método deve ser considerado para desenvolver um método de SEC robusto e reprodutível. Então, a ideia do SEC ser considerado “plug and play”, não se concretiza.

Há muitos parâmetros de desenvolvimento de método SEC para ajustar visando um perfil SEC mAb. Certamente, o tamanho dos poros/faixa de exclusão de uma coluna é uma consideração, embora, o tamanho padrão dos poros de 290-300Å já demonstrou repetidas vezes ser a melhor coluna para análise de agregados de mAb. A vazão também pode ser usada para melhorar a separação de espécies de maior peso molecular; diminuir a taxa de fluxo, gera aumento instantâneo na resolução.

Mas a coisa mais impactante que se pode fazer para melhorar a separação de mAbs é a otimização da fase móvel.

Agora, 1X PBS ou o padrão 0,2 M fosfato de potássio, 250 mM cloreto de potássio, em pH 6,2 pode funcionar para o seu método. O mAb com o qual você está trabalhando pode ter um comportamento relativamente bom nessas condições. No entanto, as propriedades físico-químicas – ou seja, a hidrofobicidade – dos mAbs podem ser quase impossíveis de prever. E cada mAb se comporta de forma diferente. O Cetuximabe não se comportará como o Trastuzumabe, que não se comportará como o Rituximabe. E esses são os IgG1’s – ainda nem falamos de isótopos como o IgG4’s, que apresentam uma série de outros desafios.

O que complica ainda mais é o fato de que, reconhecidamente, cada fabricante de coluna de HPLC usa uma química de superfície diferente para criar uma superfície inerte para separações SEC ideais. Supor que todas as colunas SEC se comportam da mesma forma seria o mesmo que a pensar que todas as C18 são iguais, quando claramente, sabemos que não são.

Lembre-se de que a Sílica é inerentemente ácida – o simples uso de sílicas não modificadas para SEC de proteínas levaria a fortes interações eletrostáticas que provavelmente causariam adsorção. Então, a mídia de HPLC utiliza um Silano Hidrofílico funcionalizado, normalmente um “diol”. Mas mesmo o chamado “Silano Hidrofílico” terá algum Carbono e isso pode causar interações Hidrofóbicas indesejadas.

O pior cenário é, como mencionado anteriormente, a baixa recuperação de Agregados de alto peso Molecular muito Hidrofóbicos.

Assim, como cada fase estacionária SEC é diferente, a Fase Móvel pode ter uma enorme implicação no desempenho do método. A densidade de ligação do Silano pode afetar a Hidrofobicidade geral do meio SEC e, nesse caso, um Tampão Cosmotrópico como o Fosfato pode “salt out” demais da proteína, levando a alargamento de banda devido às interações Hidrofóbicas. Por outro lado, uma densidade de ligação mais baixa pode levar a uma atividade de Silanol mais alta e, portanto, as interações eletrostáticas podem ser muito altas. Nesse caso, talvez seja melhor usar mais sal, como por exemplo Cloreto de Sódio.

Então, eu sei que você está pensando, vá direto ao ponto Brian, eu tenho que desenvolver um método para um novo lead mAb, por onde eu começo?

Sua melhor chance de sucesso com nossas colunas é: 50mM de Fosfato de Potássio, 250 mM de Cloreto de Potássio, em pH 6,8. Este deve ser o ponto de partida para a análise de mAb em qualquer uma de nossas colunas SEC.