Como Escolher o Solvente Adequado

A fase móvel usada para HPLC de fase reversa pode ser um solvente puro, uma combinação de solventes ou um solvente que contém tampões e aditivos. O solvente da fase móvel atua como um transportador para o analito através da fase estacionária sem afetar os resultados. Existem literalmente centenas de solventes para escolher, o que pode tornar extremamente desafiador decidir qual é o mais adequado para suas necessidades.

Características dos Solvente de Fase Móvel

Felizmente, existem algumas características dos solventes de fase móvel que podem ajudá-lo a escolher o mais adequado para sua análise em cromatografia líquida de fase reversa. Essas características incluem:

• Pureza do solvente – O solvente selecionado como fase móvel em LC deve ser de grau HPLC ou MS, deve ser filtrado e sonicado para garantir uma absorção mínima no UV e estar livre de bolhas de ar.
• Viscosidade do Solvente – A fase móvel de fase reversa deve ter uma viscosidade ideal, para ajudar a garantir uma velocidade linear ideal através da coluna de HPLC que, por sua vez, fornece picos mais finos, melhorando a sensibilidade geral da análise.
• Índice de Refração – Esta é uma consideração fundamental ao usar um detector de índice de refração. Idealmente, ao trabalhar com um detector de índice de refração, a fase móvel e o diluente da amostra devem ter um índice de refração semelhante para evitar picos negativos, em outras palavras, a amostra deve ser preparada na fase móvel.
• Ponto de Ebulição do Solvente – É melhor escolher um solvente com ponto de ebulição baixo para aumentar a recuperação e especialmente em LC-MS, um solvente mais volátil melhorará a ionização levando a um aumento da sensibilidade no MS.
• Não-Corrosividade – O solvente da fase móvel não deve corroer os tubos de HPLC, as válvulas e selos da bomba, e outras partes que fazem parte do percurso da fase móvel.
• Toxicidade do Solvente – Certifique-se de que o solvente não é tóxico e use a versão estabilizada.
• Miscibilidade do Solvente – Escolha um solvente que seja perfeitamente miscível com a amostra. O analito também deve ser solúvel nele. Caso contrário, você experimentará precipitação de amostra nos frits de entrada da coluna, gerando aumento de pressão, problema de linha de base, picos menos sensíveis para o seu analito e problemas de área e de forma de pico no cromatograma.

• Transparência da Fase Móvel– Selecione uma fase móvel que transmita na faixa de comprimento de onda de detecção.

• Força de Eluição –Esta é a capacidade do solvente de eluir analitos-alvo da fase estacionária. Quanto maior a força de eluição, mais eficaz é o solvente e melhor é a seletividade. O solvente da fase móvel deve ter força de eluição ótima e adequada para alcançar seletividade para os analitos-alvo.

Com essas características em mente, o solvente da fase móvel preferido para a maioria dos cromatografistas é a Acetonitrila, pois possui viscosidade ideal, boa transparência UV e força de eluição adequada. Outros solventes comuns incluem metanol, que tem uma viscosidade maior que a Acetonitrila (principalmente quando misturado com água), e Tetraidrofurano (THF), que tem uma alta força de eluição, mas é mais tóxico e apresenta problemas de segurança. O Éter Metil Terc-Butilico pode atuar como um substituto para o Tetraidrofurano.

Escolhendo Tampões e Aditivos de Fase Móvel

Além de escolher seus solventes da fase móvel, você também precisará escolher os tampões e/ou outros aditivos apropriados. Os tampões são usados para controlar o pH da fase móvel. Aditivos ácidos (pH de 2 a 4) são usados para a maioria das aplicações farmacêuticas, enquanto fases móveis básicas (pH maior que 8) são usadas para alcançar maior retenção e melhorar a forma dos picos para analitos básicos.

A Simplicidade é a Melhor Escolha para Fases Móveis

Escolher uma fase móvel mais simples para HPLC de fase reversa está se tornando a norma. A praticidade disso é evidente com os avanços na fase estacionária das colunas e na tecnologia de fabricação, bem como disponibilidade de instrumentos de alta resolução extremamente sensíveis. Isso reduz a necessidade de tampões e outros aditivos que eram anteriormente essenciais para uma boa cromatografia.

Por exemplo, a mistura de Acetonitrila com água a 95% era tradicionalmente feita para melhorar a eficiência da mistura, garantindo que as duas fases móveis fossem semelhantes em viscosidade e tensão superficial. No entanto, isso está se tornando cada vez mais desnecessário com melhorias das bombas e a introdução de misturadores online.

Além disso, os métodos estão se tornando mais robustos com o uso de solventes mais simples que têm perfis de gradiente linear. Com os avanços na tecnologia de MS de alta resolução, a complexidade das fases móveis em métodos de LC está se tornando cada vez mais dispensável.