por Allcrom
Medição de Ácido Tranexâmico a partir de Microamostras para Controlar a Hemorragia
por Allcrom
Um artigo de Stanislas Grassin-Delyle e outros pesquisadores, em três instituições no Reino Unido e na França, publicado na edição de junho de 2020 da Bioanalysis, relatou a validação bem-sucedida do medicamento Antifibrinolítico Ácido Tranexâmico (TXA) a partir de amostras de sangue total e microamostras de sangue seco. O Ácido Tranexâmico é comumente usado para ajudar a parar o sangramento, aumentando a coagulação do sangue, normalmente para pacientes propensos a sangramento nasal frequente ou sangramento menstrual intenso.
O artigo resumido aqui é intitulado “Quantificação de Ácido Tranexâmico em sangue total humano usando amostras líquidas ou dispositivos volumétricos de microamostragem absorvente”. Ele descreve a otimização e validação completa do método deste medicamento de ambas as matrizes, usando dispositivos Mitra® com Tecnologia VAMS® para a amostragem volumétrica de sangue seco.
Também discute o teste do método em pacientes em um ensaio clínico de fase 1. O grupo de pesquisa concluiu que esses métodos podem ser usados em estudos subsequentes para uma melhor compreensão da farmacocinética e farmacologia do Ácido Tranexâmico.
Impacto do sangramento descontrolado ou hemorragia
Uma revisão no New England Journal of Medicine (2018) relatou que cerca de 60.000 americanos morrem por perda de sangue a cada ano. Em todo o mundo, esse número é de quase dois milhões, e 75% desses casos ocorrem como resultado de trauma. Os medicamentos que podem melhorar com segurança a coagulação do sangue para impedir a perda de sangue com risco de vida são vitais para reduzir a taxa de mortalidade por hemorragia.
Um dos medicamentos mais eficazes (Ácido Tranexâmico) para tratar hemorragias, data da década de 1960, do laboratório de Utako e Shosuke Okamoto no Japão. A droga foi desenvolvida em um esforço para reduzir a morte por perda de sangue, especialmente na hemorragia pós-parto – uma das principais causas de morte de mulheres japonesas na época. O Ácido Tranexâmico é uma forma mais potente do Ácido Épsilon-aminocapróico (EACA), uma entidade química que foi testada pelo grupo de Okamoto na década de 1950.
O Ácido Tranexâmico é derivado sinteticamente do Aminoácido Lisina e seu principal modo de ação é inibir a Enzima Plasmina, que então atua para deslocar o Plasminogênio de Zimogênio da superfície de outra Proteína Fibrina. A Plasmina é uma Serina Protease, que atua para dissolver coágulos sanguíneos de Fibrina. Se a Plasmina for inibida, os coágulos são impedidos de serem dispersos, minimizando assim a perda de sangue através deste mecanismo.
Pesquisa sobre Ácido Tranexâmico
Como o Metotrexato (discutido em um blog recente), outro medicamento que remonta à década de 1960, ainda há mais a aprender sobre o Ácido Tranexâmico. Normalmente, o Ácido Tranexâmico é administrado por via intravenosa, especialmente em pacientes com hemorragia aguda com risco de vida, porque a infusão intravenosa é um método confiável para administrar rapidamente o medicamento.
A farmacocinética de outras vias de administração de medicamentos é pouco compreendida. Devido a essa falta de conhecimento farmacocinético, o grupo de pesquisa que foi co-autor do artigo resumido aqui, embarcou em um estudo de viabilidade para investigar rotas de dosagem alternativas. O grupo optou por usar Dispositivos Mitra® baseados na Tecnologia VAMS® porque estes são baseados em microamostragem volumétrica capilar.
Esse tipo de dispositivo pode ser usado remotamente, o que elimina a necessidade de Flebotomistas, pois as amostras podem ser coletadas por praticamente qualquer pessoa, em qualquer lugar e a qualquer momento. Os pesquisadores comentaram que o processamento de amostras de VAMS® de sangue seco seria mais eficiente durante a extração em laboratório em comparação com a produção de soro ou plasma antes da extração.
Método de Estudo do Ácido Tranexâmico e Resultados
Sangue total líquido e Dispositivos Mitra-VAMS® de sangue seco (ambos 10 µL) foram comparados.
Ambas as matrizes foram extraídas em Água/Metanol (20/80, v, v) mais Padrão interno (IS).
A extração das pontas VAMS® foi otimizada exigindo maior tempo de agitação e sonicação. As recuperações de extração foram altas (93-101%).
Uma faixa de hematócrito (30-70%) foi então testada; os pesquisadores concluíram que o hematócrito não afetou as medições de Ácido Tranexâmico com dispositivos VAMS®. Quando a Acetonitrila foi avaliada, ela produziu formas de pico muito ruins.
A análise foi realizada usando LC-MS/MS.
A validação bem-sucedida do método foi realizada de acordo com as diretrizes da Agência Europeia de Medicamentos e da Food and Drug Administration (FDA) dos EUA para o desenvolvimento de métodos bioanalíticos.
Os destaques da validação do método estão listados a seguir:
- Nenhuma transferência ocorreu mesmo após a Limite Superior de Quantificação (LSQ).
- O Limite Inferior de Quantificação (LIQ) foi ajustado para 0,1 mg/L, onde ambas as matrizes passaram pela precisão e exatidão intra e inter-dia.
- Efeitos de matriz de 19,2-38,7% foram observados em dois níveis de concentração, mas o padrão interno foi capaz de compensar e os Coeficientes de Variação (CV) do padrão interno do método normalizado foram inferiores a 10%.
- Os extratos VAMS® permaneceram estáveis por 1 mês a 50° C
- Nenhuma transferência ocorreu mesmo após a Limite Superior de Quantificação (LSQ).
A adequação do método foi testada em 5 voluntários que estavam participando de um ensaio clínico de fase 1 intitulado “Farmacocinética do Ácido Tranexâmico após administração oral, intramuscular ou intravenosa: um ensaio prospectivo, randomizado e cruzado em voluntários saudáveis (Fármaco TXA).”
Após cada evento de dosagem, amostras venosas e capilares de VAMS® foram coletadas. As amostras venosas foram armazenadas a -80° C e as amostras VAMS foram armazenadas à temperatura ambiente antes da análise. Excelente concordância foi observada entre ambas as matrizes e o grupo comentou que isso demonstrou a viabilidade de medir o TXA nessas amostras de sangue total.
Um estudo de validação clínica está em andamento.
Conclusões dos Autores do Estudo do Ácido Tranexâmico
Este foi o primeiro método para quantificar o Ácido Tranexâmico em amostras líquidas de sangue total e amostras VAMS® secas.
O ensaio foi validado com sucesso e, mesmo com apenas 10 µL de microamostras, o método mostrou uma alta faixa dinâmica.
Ambas as matrizes mostraram excelente concordância, e ambas podem ser usadas em estudos para entender a farmacocinética e farmacologia do Ácido Tranexâmico (TXA).
O Ácido Tranexâmico é altamente estável a 50 °C em pontas VAMS®, o que permite que os pesquisadores realizem estudos farmacocinéticos adicionais para melhorar os regimes de dosagem de todas as populações de pacientes.
Conclusões dos Autores do Estudo do Ácido Tranexâmico
Otimizar as condições de extração é fundamental para fornecer validações bem-sucedidas. Stanislas Grassin-Delyle e outros pesquisadores, avaliaram várias condições e encontraram um procedimento ideal que produziu uma recuperação de extração muito alta. Em termos de escolha do solvente de extração, a Acetonitrila deu formas de pico ruins, o que foi possivelmente devido à incompatibilidade da fase móvel do solvente de injeção. No entanto, em contraste, o solvente de extração de Metanol/Água mais fraco produziu formas de pico muito aceitáveis.
Deve-se notar que, se houver uma situação em que a extração em um solvente forte forneça condições ideais de extração, mas forneça formas de pico ruins, existem várias estratégias para resolver isso. A primeira é simplesmente diluir a amostra com água, após a extração. No entanto, aqui é importante verificar a solubilidade da amostra e se há sensibilidade suficiente para o método. Se a sensibilidade for um problema e se a amostra for fraca o suficiente, a injeção de um volume maior às vezes ajuda.
Outra solução é injetar um volume menor do extrato não diluído no LC-MS/MS, mas, novamente, você pode enfrentar problemas de sensibilidade. Finalmente, uma solução comum é evaporar até a secura e reconstituir na fase móvel A. Esta solução pode ser altamente bem-sucedida, embora possam ser observadas perdas, com o analito seco aderindo ao lado do recipiente.
Para saber mais sobre o Dispositivo Mitra® e sua aplicabilidade entre em contato com [email protected]