Microamostragem para medir Biomarcadores Relacionados ao Triptofano
por Allcrom
Um artigo de Michele Protti em conjunto com outros pesquisadores da Universidade de Bolonha na Itália e outras instituições, publicado na edição de setembro de 2022 da Molecules, investigou o uso de Dispositivos Mitra® com Tecnologia VAMS® para Triptofano (Trp) e biomarcadores relacionados. O artigo é intitulado “Microamostragem Volumétrica Absorvente (VAMS) para Determinação Direcionada por HPLC-MS/MS de Biomarcadores Relacionados ao Triptofano”.
Este estudo piloto mediu com sucesso 24 biomarcadores metabolômicos de três vias metabólicas principais. Os autores concluíram que este método – usando extratos de amostras VAMS® e HPLC-MS/MS – pode ser aplicado para analisar metabólitos de Triptofano e níveis de biomarcadores relacionados para monitorar condições de doenças, realizar estudos mecanísticos e investigar os resultados de intervenções terapêuticas.
A Importância da Pesquisa de Biomarcadores em Metabolômica.
Por que Metabolômica?
A metabolômica nos dá um retrato instantâneo das vias metabólicas dentro de nossas células e espaços extracelulares, incluindo contribuições do bioma. De fato, a mesma revisão de Michael A Kiebish com outros pesquisadores relatou que o banco de dados metabólico humano, ou HMDB, listou >25.000 metabólitos no sangue humano. Compreender as vias metabólicas e como elas interagem com a doença pode ajudar a diagnosticar e prever condições. Acredita-se que os metabólitos possam atuar como um barômetro da saúde de um indivíduo antes do início de qualquer doença.
De fato, uma família de metabólitos de grande interesse para o diagnóstico e tratamento de diversas condições, como doenças neurodegenerativas e cânceres, está relacionada a metabólitos encontrados em vias relacionadas ao Triptofano (Trp). Por exemplo, uma via específica que é de grande interesse para os pesquisadores é a via da Quinurenina (KP) da degradação do Triptofano. Além disso, enzimas como indoleamina-2,3-dioxigenase 1 e 2, bem como triptofano-2,3-dioxigenase (TDO) são alvos de terapias, com vários compostos em ensaios clínicos que investigam uma classe chamada inibidores de ponto de controle imunológico.
Um dos principais desafios para a pesquisa metabolômica é a coleta de amostras, não apenas para facilitar a coleta de sangue em pesquisas clínicas ou ensaios em humanos, mas também em estudos pré-clínicos envolvendo animais de laboratório. Os camundongos são muitas vezes o animal de laboratório de escolha para amostragem de sangue durante estudos in vivo conduzidos em pesquisas pré-clínicas. No entanto, coletar amostras de sangue de camundongos de maneira ética pode ser um desafio, porque os camundongos normalmente têm apenas cerca de 1,5 a 2,8 mL de sangue. Isso significa que mais camundongos podem ser necessários para coletar um número suficiente de amostras de sangue necessárias para a coleta de dados. Isso representa um dilema, já que os laboratórios de pesquisa se esforçam para usar o menor número possível de animais para concluir seus estudos.
Um dos motivos foi porque os Dispositivos baseados em Microamostragem Volumétrica Absorvente podem superar vários dos desafios da antiga tecnologia de “gota de sangue seco”. Um desses desafios é o viés de dispersão de pontos no efeito volumétrico associado ao hematócrito. Portanto, a equipe embarcou em um estudo de prova de conceito para avaliar a Tecnologia VAMS® para análise de 24 biomarcadores relacionados ao triptofano.
Método de estudo de Triptofano e descobertas.
- Biomarcadores (n=24) pertencentes a 3 vias do Triptofano (incluindo a via da quinurenina foram selecionados).
- Um ensaio de HPLC-MS/MS foi empregado usando uma coluna Pentafluorofenil (PFP) para medir simultaneamente todos os 24 analitos dos extratos de amostras VAMS® (10 µL).
- O grupo usou um método de adição padrão usando sangue em padrão branco e sangue em padrão branco fortificado, pois os analitos em questão eram moléculas endógenas.
- O método se concentrou na avaliação da precisão, carryover (contaminação cruzada), recuperação absoluta, linearidade, sensibilidade, seletividade e estabilidade.
- A otimização da extração foi realizada, e envolveu a análise em metanol, acetonitrila (ACN) e misturas em água, condições ácidas e básicas. As condições ideais envolveram uma mistura Acetonitrila e água incluindo ultrassom, vórtex e centrifugação.
- As eficiências de extração foram altas para todos os analitos (>85%) e padrões internos (>91%) em três concentrações (baixa, média e alta).
- Baixos Desvios-Padrão Relativos (DPRs) foram observados em todas as três concentrações testadas (<9,6% para os analitos e <7,3% para os Padrões Internos).
- O efeito de matriz foi entre 78 – 96% e nenhum carryover (contaminação cruzada) foi observado.
- O método foi seletivo, pois todos os analitos foram determinados satisfatoriamente e identificados de forma inequívoca usando o monitoramento de múltiplas reações.
- A sensibilidade do método ficou com limites de quantificação (LQs) entre 0,1-25 ng/mL, pois isso foi limitado pela utilização do método de adição padrão. Para Triptofano, o LQ teórico teria sido bem menor (ng/mL). Por esse motivo, o LQ foi calculado na menor concentração adicionada à amostra que poderia ser medida com segurança (exatidão ± 20% e precisão < 20%).
- A linearidade do método foi boa para todos os analitos (Coeficiente de determinação r2 >0,9987).
- As amostras permaneceram estáveis nas pontas VAMS® a 24 ± 4° C por pelo menos 30 dias. O grupo declarou que essa boa estabilidade era promissora para o uso da Tecnologia VAMS® para estudos de biomarcadores direcionados como este, sem observar vieses temporais e de temperatura (sob as condições testadas).
- O método foi então testado em 3 amostras de três camundongos adicionando sangue em diferentes concentrações de analito. A precisão foi relatada em 90-107%.
Conclusões dos autores do estudo.
- Este estudo marcou o primeiro uso dos Dispositivos Mitra com Tecnologia VAMS® para biomarcadores relacionados ao Triptofano em um ensaio de HPLC-MS/MS (para melhor conhecimento dos autores).
- A extração foi otimizada em 100 µL de Acetonitrila e H2O usando extrações auxiliadas por ultrassom e vórtex.
- Mitra® foi considerado um método de amostragem confiável para medir biomarcadores relacionados ao Triptofano de três vias principais, determinados com sensibilidade adequada e boa precisão.
- Recuperações satisfatórias (>85%) foram observadas para todos os analitos e boa seletividade, precisão e exatidão foram observadas.
- Nenhum problema de estabilidade foi observado nas condições testadas.
- Este método abre a possibilidade de amostragem Mitra® em biomarcadores e estudos direcionados no campo de compostos relacionados ao Triptofano em diferentes campos de pesquisa.
Comentários Neoteryx
O desenvolvimento de métodos confiáveis e bem validados é fundamental para as estudos ômicos emergentes. A conversão de abordagens de microamostragem volumétrica e metodologias analíticas altamente sensíveis, como HPLC-MS/MS (conforme utilizado neste estudo), abre as portas para a revolução do monitoramento de saúde personalizado. De fato, os Dispositivos de Microamostragem Mitra® têm sido usados em uma ampla variedade de estudos ômicos, desde a medição de microRNA para pesquisa de biomarcadores até proteômica e metabolômica direcionada e não direcionada.
De fato, um artigo recente de proteômica não direcionado identificou mais de 1.642 proteínas de um dispositivo Mitra® de 30 µL, tal é o poder das modernas metodologias e instrumentação de HPLC-MS/MS.
Este é um conteúdo com curadoria.
Para saber mais sobre o Dispositivo Mitra® usado no estudo da Stanford Medicine, entre em contato com um de nossos especialistas através do email: [email protected]