Por que a C18 é a Fase Estacionária mais Popular para a Fase Reversa?
Autor convidado: Seyed Sadjadi, Cientista Sênior
Vamos explorar quais os motivos que fazem da Fase Estacionária C18 ser a mais usada quando se trata da Fase reversa, e como ela funciona. É provavelmente mais apropriado referir-se a Fase Estacionária C18 como uma das Substâncias Químicas mais abundantes disponíveis. Certamente não há escassez das variedades cada vez mais crescentes dessa Fase entre os fornecedores de Colunas de Cromatografia. No entanto, antes de nos aprofundarmos no alvo de estudo em questão, aqui está uma breve revisão de como a Fase estacionária C18 surgiu.
No início, Mikhail Tsvet, um botânico russo, tentou isolar e separar os pigmentos naturais (Carotenoides, Clorofila etc.) em tecidos vegetais. Como já era de se esperar, o que Tsvet usou para seu experimento de separação NÃO era altamente refinado, completamente poroso, com formato esférico perfeito e com partículas de Sílica de tamanhos uniformes reforçadas a uma ligação C18, compactadas firmemente em um tubo de Aço Inoxidável de Alta qualidade! Ele usou os materiais que a natureza ofereceu, minerais e sais de pedra (sais de Cálcio), como a Fase Estacionária e uma mistura de Etanol como sua Fase Móvel. Tsvett nomeou essa técnica de separação de “Cromatografia”, que hoje é um ramo importante da Química Analítica.
Cromatografia de Fase Reversa
Nos primeiros experimentos de Cromatografia (projeto de Tsvet), os Analitos Hidrofóbicos foram primeiramente Eluídos da Coluna seguidos por compostos Polares e muito Hidrofílicos. Essa ordem de Eluição foi chamada de Cromatografia de Fase Normal (Normal Phase Chromatography, NP). Várias décadas depois, e com muitos outros cientistas envolvidos nesse campo, modos de separação adicionais foram introduzidos na Cromatografia para resolver e purificar muitas classes de compostos em muitas matrizes diferentes. Por mais empolgante (!!!) que seja abranger todas essas novas adições, vamos nos concentrar somente em uma, Cromatografia de Fase Reversa (Reverse Phase, RP).
Em um Sistema Cromatográfico, os Analitos Iônicos e muito Polares eluem primeiro da Coluna, seguidos por Analitos mais Hidrofóbicos. Os compostos eluem na ordem oposta em comparação com os experimentos de Tsvet. Assim, esse Sistema é chamado de Cromatografia de “Fase Reversa”.
O objetivo final da técnica de RP (Fase Reversa) é separar os analitos com graus variados de Hidrofobicidade. Em resumo, essa tarefa é realizada por meio de:
1. Uso de uma Fase Estacionária Hidrofóbica para reter os Analitos.
2. Modificação e Otimização de um Sistema de Solvente com vários componentes com capacidade diferencial para atuar como um bom Solvente para os analitos-alvo. Isso inclui Solventes Orgânicos e Soluções-Tampão, quando aplicável. Nem todos os compostos são fortemente Ácidos ou Básicos, mas, em vez disso, podem ter grupos Polares que exigem uma faixa de pH estreita para controlar seu comportamento.
1. Fase estacionária Hidrofóbica
Os Hidrocarbonetos são um exemplo perfeito de Hidrofobicidade e são, na verdade, substâncias oleosas. Mais especificamente, os Alcanos de cadeia linear são bem adaptados para servir como uma boa Fase Estacionária. Devemos observar que, à medida que os Átomos de Carbono na cadeia aumentam, as propriedades físicas do Hidrocarboneto também mudam, C1 a C4 são gasosas; C5 a C17 são líquidas; C18 e maiores são sólidas. Além dos Alcanos, há outros candidatos, como os Alcanos Aromáticos e Cíclicos, que podem ser igualmente viáveis aqui como Fase Estacionária. Essas outras Fases Estacionárias serão discutidas em outros artigos. A popularidade da C18 pode ser em razão da disponibilidade antecipada do material inicial para o processo de ligação. Essa feliz coincidência levou a uma descoberta adicional de como a C18 se adaptou bem ao processo Cromatográfico. De qualquer forma, ambos os fatores ajudaram a promover a C18 como a campeã indiscutível das Fases Estacionárias de Fase Reversa.
A próxima etapa é fixar o grupo Alcano, especificamente C18 ou Octadecila, a uma superfície adequada. A Sílica superou todos os outros meios que foram considerados, e as Partículas de Sílica estão disponíveis em muitos formatos (esféricos regulares ou irregulares), tamanhos (0,9 a 10 μm e maiores), porosidades (de até 1000 μg) e é totalmente porosa ou tem um núcleo Sólido por padrão.
Após o processo de ligação ser concluído (muitos dos detalhes desse processo são mantidos confidenciais), uma ligação C18 se liga a Sílica em um nível molecular e uma colocação física mais genérica dentro de um Poro de partículas de Sílica conforme as imagens abaixo.
Figura 1. Ligação C18 ligada ao Dióxido de Silício
Figura 2. Representação genérica de duas moléculas de ligação C18 na superfície dos Poros de Sílica
2. Mecanismo de retenção RPC
A beleza e a simplicidade da Fase Estacionária da C18 é que ela oferece uma interação Hidrofóbica muito simples. Como os Solutos na Fase Móvel viajam através dos Poros de Sílica, eles podem ser atraídos e mantidos pelo Hidrocarboneto através de uma interação Hidrofóbica (e força de Van der Waals) bastante fraca. A Figura 3 representa essa interação.
Figura 3, uma interação Hidrofóbica simples entre uma ligação C18 e um composto.
A Figura 4 mostra que há uma interação Hidrofóbica entre a ligação C18, o anel de Benzeno do composto e sua fração de grupo Propil (circulado). A atração entre a ligação C18 e a fração de Amina do outro lado da molécula é mínima devido a presença de uma carga positiva sobre o Nitrogênio.
Um parâmetro que indica o grau de Hidrofobicidade de um composto é chamado de log de P. Esse valor é a constante de equilíbrio de um Composto depois de ser colocado em uma mistura de Água e n-Octanol. Um valor de log de P positivo indica que o composto-alvo é mais Solúvel em n-Octanol e, portanto, é de natureza mais Hidrofóbica. Um log de P negativo indica uma molécula solúvel em Água e, portanto, com uma natureza mais Hidrofílica. A Figura 4 mostra uma lista de várias classes de Compostos com intervalos de log de P aproximados.
Figura 4. Escala de log de P para várias classes de Compostos
Figura 5. Apresentação gráfica de conjugados Ácidos fracos e Básicos em função do pH.
Até agora, abrangemos apenas um componente da Fase Móvel, especificamente a porção aquosa. Isso nos levou a usar várias propriedades Químicas para ajudar a aumentar a retenção do Analito em uma Fase Estacionária C18. Agora, é natural discutir como eluir os Analitos de uma Fase Estacionária C18.
Para superar a interação Hidrofóbica sob condições de Fase Reversa, Metanol (MeOH), Acetonitrila (ACN) e Tetraidrofurano (THF) são os solventes primários escolhidos. Em ordem de potência, o MeOH é considerado o Solvente mais fraco e o THF é o mais Forte. Essa potência se traduz em quão rápido os Analitos eluem com cada Solvente. Considerando a proporção idêntica na Fase Móvel (MP), um único Analito elui muito mais rapidamente, com o THF como Solvente, do que os outros. No entanto, a potência do Solvente não gera seletividade proporcional quando mais de um Analito é considerado. No próximo artigo, abordaremos a diferença na seletividade do Solvente na Cromatografia de Fase Reversa.
Concluindo, a C18 é uma das Fases Estacionárias mais simples e práticas disponíveis para Cromatografia de Fase Reversa.
Sou a Rafaela Barbosa, achei seu artigo excelente! Ele
contém um conteúdo extremamente valioso. Parabéns
pelo trabalho incrível! Nota 10.
Olá Rafaela! Ficamos gratos em saber disso, nossa intenção é sempre agregar conhecimento diferenciado. Estamos sempre à disposição.