Pré-coluna de HPLC e UHPLC
Autor: Rajesh Babu Dandamudi, Ph.D., Gerente Técnico da Phenomenex
Hoje de manhã, eu estava assistindo a um vídeo encaminhado por um dos meus amigos que amam motocicletas. Era o vídeo de uma corrida do MotoGP em que um dos pilotos perdeu o controle da moto e acidentalmente escorregou. Os pilotos atrás dele, sem prever esse evento repentino, bateram uns nos outros, resultando em uma pilha de motos. Felizmente, o acidente não foi fatal e todos os pilotos sobreviveram. Quando tentei entender como esses pilotos foram salvos, percebi que foi por causa do equipamento de proteção que estavam usando.
A segurança do piloto é de extrema importância quando se trata de corridas de motocicleta, então eles se protegem usando o melhor equipamento de proteção, antecipando o pior. Da mesma forma, uma Coluna HPLC-UHPLC é o componente principal na Cromatografia Líquida porque a Coluna é a responsável pela Separação dos Analitos em uma Matriz. Proteger e cuidar da Coluna garante que não apenas obtenhamos resultados confiáveis, mas também o funcionamento sem problemas. Todos nós sabemos que uma Coluna HPLC-UHPLC tem uma vida útil finita, mas como podemos garantir a vida útil máxima?
Para responder a essa pergunta, vamos primeiro ver as possíveis maneiras pelas quais uma Coluna pode ser obstruída?
Matriz da Amostra:
As Amostras introduzidas na Coluna HPLC-UHPLC são frequentemente diversas e complexas. Essas Amostras têm muitos Componentes que podem não ser compatíveis com as condições do Método de HPLC-UHPLC. A injeção dessas Amostras sem a preparação/pré-tratamento apropriado pode levar ao entupimento da Coluna.
Proteínas Residuais e Compostos altamente Hidrofóbicos, como Lipídios, também podem não ser completamente Eluídos durante Separações de Fase Reversa, já que tendem a ser lentamente Adsorvidos na Coluna e causar problemas.
Fase Móvel e Diluente da Amostra Incompatíveis:
Se o Diluente da Amostra não for compatível com a Fase Móvel, então, quando uma Amostra é introduzida na Fase Móvel, há uma possibilidade de Precipitação da Amostra. Isso é frequentemente visto quando os Diluentes são muito Polares ou muito Apolares em relação a Fase Móvel.
Tampões na Fase Móvel:
Tampões são frequentemente usados como Fase Móvel em HPLC-UHPLC. É importante que esses Tampões de sais sejam Filtrados antes do uso. Algumas vezes, devido à diferença de Temperatura no Laboratório, alguns dos componentes do Tampão tendem a Precipitar. Usar uma concentração muito alta de Tampão também leva à Precipitação. Atenção na proporção de orgânico na fase móvel quando utilizado com tampão, alta proporção também pode causar precipitação com alguns tampões.
Fragmentos de selos da bomba/selos do rotor do injetor desgastadas:
As vedações da bomba e do rotor do injetor são frequentemente feitas de borracha. Devido ao desgaste normal, esses Componentes tendem a gerar alguns Resíduos nas linhas de Solventes. Se a manutenção periódica das bombas e das portas do injetor não forem feitas, os Resíduos tendem a atingir o filtro da Coluna e obstruí-la.
Agora que conhecemos as possíveis maneiras pelas quais uma Coluna pode ser obstruída, como a protegemos?
Para proteger as Colunas de HPLC-UHPLC (Analíticas e Preparativas) de contaminação, como Partículas de injeção, componentes de Fase Móvel não filtrados ou fragmentos de vedações desgastadas da bomba/vedações do rotor do injetor, recomenda-se usar uma Pré-Coluna.
A próxima pergunta óbvia é: o que é uma Pré-Coluna?
Uma Pré-Coluna é essencialmente uma Coluna pequena, preferencialmente empacotada com o mesmo material da Coluna Analítica e é conectada antes da Coluna. Essas Pré-Colunas vêm em várias dimensões para corresponder as exigências das Colunas. O filtro da Pré-Coluna é como o da Coluna Analítica. Isso significa que qualquer coisa que poderia possivelmente entupir a Coluna Analítica seria bloqueada na Pré-Coluna. Esse bloqueio pode ser resolvido simplesmente substituindo os Cartuchos Pré-Coluna, protegendo, assim, a vida útil da Coluna Analítica.
Componentes do SecurityGuard™
Vista em corte do SecurityGuard mostrando que o cartucho de Pré-Coluna pode ser substituído facilmente quando contaminado.
Para entender o papel de uma Pré-Coluna na vida útil da Coluna, realizamos um teste de vida útil acelerado usando uma Matriz Biológica Endógena injetada em uma Coluna Core-Shell (Coluna Kinetex 2,6 μm C18 50 × 4,6 mm Phenomenex, Inc. Torrance CA, EUA). Com a Coluna desprotegida (pontos cinzas, figura abaixo), as injeções sequenciais da Matriz levam a um aumento constante e irreversível da Pressão. Sem a Pré-Coluna SecurityGuard ULTRA, o aumento da Contrapressão tornou-se exponencial. Esse aumento na Contrapressão acabaria por levar à deterioração da Cromatografia, incluindo alargamento da Banda e possivelmente divisão do Pico. Como resultado, a sensibilidade do Método, a quantificação e identificação do Pico também podem ser prejudicados.
No entanto, a vida útil da Coluna foi bastante estendida usando o SecurityGuard ULTRA (pontos pretos, mostrados acima). Neste caso, as injeções sequenciais da Matriz ainda levam a um aumento na Pressão, mas isso ocorre devido às Partículas capturadas no próprio SecurityGuard ULTRA e não na Coluna HPLC-UHPLC. Assim, simplesmente substituindo o Cartucho SecurityGuard ULTRA em intervalos regulares, a contrapressão voltou aos níveis iniciais e a vida útil efetiva da Coluna foi bastante estendida.
Quando eu troco meus Cartuchos?
Inspecione visualmente a superfície do material de Empacotamento do Cartucho a qualquer momento, sem mexer na base do Empacotamento. Agora você pode monitorar facilmente o acúmulo de contaminantes e trocar seu Cartucho de Pré-Coluna antes que seja tarde demais! Se seus contaminantes são Incolores substitua o Cartucho, tão frequentemente quanto necessário, para manter o desempenho Cromatográfico (por exemplo, quando a Resolução diminui em 10% e/ou quando a Eficiência/Larguras de Pico diminuem em 20%) ou se a contrapressão do sistema aumentar em mais de 20%.
Quais são características que devo buscar ao comprar uma Pré-Coluna?
- O material de Empacotamento (Fase Estacionária) do Cartucho da Pré-Coluna deve ser o mesmo que o da Coluna Analítica, para que não haja alteração na Seletividade.
- O diâmetro interno do cartucho da Pré-Coluna deve ser igual ou menor que o diâmetro interno da Coluna Analítica, para evitar o alargamento da banda. Sempre use uma Pré-Coluna com diâmetro interno mais próximo ao da Coluna.
- O comprimento da Pré-Coluna deve ser o mínimo possível para evitar volumes mortos adicionais.
- Os Cartuchos devem ser fáceis de substituir, sempre que necessário.
SecurityGuard Standard: Recomendado para uso com todas as Colunas de Partículas não Core-Shell e de Partículas ≥ 3 μm ((< 5.000 psi / 345 bar)*), são compatíveis com praticamente todas as Colunas HPLC-UHPLC.
SecurityGuard ULTRA: Recomendado para uso com todas as Colunas Core-Shell
e/ou de Partículas < 3 μm (< 20.000 psi / 1.378 bar).
SecurityGuard PREP: Recomendado para uso com Colunas HPLC Preparativa com diâmetro interno (DI) de 9,0 a 49,0 mm.