por Allcrom
Usando LC-MS/MS para Medir mAbs de Extratos de Amostras VAMS®
por Allcrom
Um artigo publicado por X. Gao e Y. Xu junto com outros pesquisadores na edição de Janeiro de 2021 do Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis demonstrou uma validação completa de um Anticorpo Monoclonal Terapêutico (mAb) usando Dispositivos Mitra® baseados na Tecnologia VAMS®. Os investigadores incluíram amostras clínicas e de primatas não humanos em seu estudo.
O artigo é intitulado “Microamostragem volumétrica absorvente (VAMS®) na quantificação de Proteínas terapêuticas por LC-MS/MS: Investigação do impacto anticoagulante no desempenho do ensaio e recomendações para as melhores práticas no desenvolvimento do método.” Este artigo descreve o primeiro uso de LC-MS/MS para quantificação de mAbs de extratos de amostras VAMS® retirados de sangue venoso (coletado de um tubo) e sangue capilar (coletado por punção digital).
Além disso, o artigo destaca a importância de avaliar o impacto do anticoagulante e escolher o padrão interno correto ao comparar sangue capilar versus sangue venoso estabilizado.
Estudos sobre Terapia de Anticorpos Monoclonais
Nas últimas três décadas, os anticorpos monoclonais (mAbs, uma classe terapêutica de Proteínas grandes) vêm ganhando popularidade como uma abordagem de imunoterapia para tratar algumas doenças. Um desses medicamentos que ganhou popularidade é o Humira, um bloqueador do fator de necrose tumoral, que atua para reduzir o inchaço e a inflamação das articulações em condições como a artrite.
Embora os primeiros estudos de terapias com mAbs tenham se baseado em amostras de sangue venoso líquido, nos últimos anos surgiram vários artigos na literatura validando extratos VAMS® advindos de sangue capilar seco para mAbs. Um desses artigos demonstrou a validação bem-sucedida de sete medicamentos mAbs usando ELISA. No entanto, até o artigo de Gao e Xu e outros pesquisadores que é revisado aqui, um método LC-MS/MS não havia sido relatado anteriormente usando extratos VAMS® para mAbs.
A análise quantitativa da terapêutica de Proteínas grandes para estudos bioanalíticos levanta uma série de desafios importantes quando comparada a pequenas moléculas de fármacos. Isso inclui o desenvolvimento de ensaios que sejam sensíveis e específicos o suficiente para os requisitos modernos de validação analítica. Para moléculas pequenas de medicamentos, o LC-MS/MS é a plataforma analítica preferida, porque oferece alta especificidade e sensibilidade.
Para terapias com uso de grandes Proteínas, houve uma série de abordagens bioanalíticas desenvolvidas, incluindo ensaio de ligação ao ligante (LBA – Ligand Biding Assay), tal como imunoensaio, e LBA-LC-MS/MS híbrido e LC-MS/MS de Proteína digerida. A última técnica envolve a precipitação de Proteínas de um fluido biológico como o Plasma e, em seguida, a reconstituição do precipitado Proteináceo em um tampão onde a amostra pode então ser digerida usando Tripsina.
Os Peptídeos resultantes atuam então como assinaturas para a Proteína original de interesse. Devido ao seu pequeno tamanho, esses Peptídeos podem então ser medidos em equipamentos LC-MS/MS padrão usados para análise de moléculas pequenas.
Devido aos benefícios do LC-MS/MS, a equipe pesquisadora decidiu usar o método de digestão de pellets para uma terapia por Proteínas. Eles afirmaram: “O LC–MS demonstrou vantagens únicas, incluindo alta especificidade, curto tempo de desenvolvimento e capacidade de multiplexação”.
Extração das Amostras – Métodos e Descobertas do Estudo
Uma validação pré-clínica foi realizada com sucesso usando amostras de macacos Rhesus de acordo com as diretrizes bioanalíticas aceitas pela indústria.
- Um foco adicional também foi colocado na validação do método para dependência de Ht (hematócrito), onde nenhum viés foi observado. Além disso, a integridade da diluição foi avaliada e a recuperação relativa da extração foi encontrada na faixa de 90-104%. A estabilidade a longo prazo foi estabelecida a 2-8°C por 98 dias. A estabilidade de até 24 horas foi observada em temperatura ambiente e 45°C em 75% de umidade.
- Em termos de desenho de estudo farmacocinético, 3 macacos foram dosados por via intramuscular e 3 por via intravenosa. As amostras foram coletadas semanalmente ao longo de 1 mês. Soro, sangue venoso e sangue capilar foram coletados em cada ponto temporal. Não foi observada diferença entre o sangue venoso e o sangue capilar, ambos coletados com Dispositivos Mitra® (R2 = 0,9861). A amostra de VAMS® de sangue total mostrou ~60% da concentração em comparação com o soro e isso foi atribuído a nenhuma partição na fração de hematócrito (~40% do volume de sangue).
- O método foi então usado em um estudo de fase 1 de dosagem IV em voluntários saudáveis. Onde amostras de soro (intravenoso) foram coletadas e armazenadas a -80°C e amostras de sangue capilar (de Dispositivos Mitra®) foram coletadas e armazenadas a 2-8°C.
- Curiosamente, as respostas do padrão interno (IS) para as amostras capilares foram significativamente maiores do que as amostras de EDTA. O grupo então investigou como identificar a causa raiz do problema.
Eles descartaram qualquer variabilidade lote a lote e relataram “Nenhuma diferença de resposta quanto ao padrão interno distinguível foi observada entre os dois formatos, bem como entre dois lotes de pontas VAMS® no mesmo formato de 96 poços”.- Eles descartaram qualquer variabilidade lote a lote e relataram “Nenhuma diferença de resposta quanto ao padrão interno distinguível foi observada entre os dois formatos, bem como entre dois lotes de pontas VAMS® no mesmo formato de 96 poços”.
- Usando estudos de pico, o grupo reduziu a causa raiz para o EDTA na amostra venosa. Eles levantaram a hipótese de que o EDTA estava quelando a metais divalentes, impedindo assim a eficácia da Tripsina. De fato, um experimento mostrou que a adição de cálcio ao extrato da amostra de EDTA recuperou os valores do padrão interno.
- Eles comentaram que a razão pela qual não viram o mesmo fenômeno nos extratos de macacos foi possivelmente devido a diferenças na abundância de Cátions entre o sangue humano e do macaco, ou talvez diferenças na concentração de ETDA de cada origem sanguínea.
- Eles propuseram que esse fenômeno deve ser testado no início do desenvolvimento do método usando sangue reunido com ou sem a presença do anticoagulante EDTA.
- Uma observação final foi que, como eles usaram o Isótopo estável rotulado (SIL)-mAb em vez de um Peptídeo substituto de SIL como padrão interno. Isso permitiu que eles observassem o problema com o EDTA. No entanto, vale a pena notar que, se eles tivessem usado um Peptídeo substituto de SIL, teriam perdido esse fenômeno, pois não teriam visto diferenças na eficiência da digestão em comparação com o sangue não EDTA. Isso sugere que o uso de padrões internos SIL (Isótopo Estável Rotulado) para análise de Proteínas em VAMS® é melhor para LC-MS/MS.
- Eles descartaram qualquer variabilidade lote a lote e relataram “Nenhuma diferença de resposta quanto ao padrão interno distinguível foi observada entre os dois formatos, bem como entre dois lotes de pontas VAMS® no mesmo formato de 96 poços”.
Discussão e Conclusões dos Autores do Estudo
- Um ensaio de VAMS de sangue total foi validado para um mAb em comparação com o soro.
- O estudo comparativo piloto de macacos mostrou “excelente correlação entre as concentrações de mAb1 medidas no soro e em VAMS®, incluindo de sangue venoso e capilar”.
- Os autores recomendam que, durante o desenvolvimento, os investigadores comparem a preparação de sangue reunido e sangue capilar de voluntários para descartar problemas com o estudo clínico.
- Utilize uma Proteína SIL (Isótopo Estável Rotulado) de tamanho normal como padrão interno, como fizeram os investigadores neste estudo.
- A equipe descobriu que “No geral, o trabalho aqui apresentado demonstra que VAMS® é uma tecnologia de amostragem confiável para a quantificação de anticorpos monoclonais”.
- Deve-se ter cuidado com o padrão interno e com a escolha do anticoagulante.
Considerações Finais
Como os Dispositivos Mitra® com Tecnologia VAMS® são implantados em ensaios cada vez mais diversos, é crucial sempre investigar quaisquer observações incomuns, como o efeito que o EDTA estava tendo na preparação da amostra. O sangue é uma matriz muito mais complexa de se trabalhar em comparação com o soro e, embora ensaios como este possam ser validados com sucesso e implantados em ensaios clínicos, fatores como a eficiência da digestão devem ser considerados para evitar outros problemas imprevistos.
Para saber mais sobre o Dispositivo Mitra® e sua aplicabilidade entre em contato com [email protected]