por Allcrom
Usando Perfil Genético para Verificar a Identidade de Amostras Remotas
Um pôster produzido em 2021 por Emma Fischer e outros pesquisadores da Promega Corporation, relatou um novo procedimento para conduzir de forma confiável o perfil genético de microamostras de sangue coletadas usando Dispositivos Mitra ® baseados na Tecnologia VAMS ®. O poster é intitulado “Extração para Eletroforese – Verificação da Identidade de Amostras de Sangue Coletadas Remotamente”. Ele descreve as etapas a serem seguidas desde a extração da amostra até a coleta de dados ômicos para gerar uma impressão digital molecular da identidade de um indivíduo a partir de uma microamostra de sangue.
Os autores concluíram que essa abordagem é uma ferramenta útil para garantir a identidade da amostra. Em seu pôster, os autores forneceram um fluxo de trabalho que inclui extração de DNA, quantificação de DNA, amplificação de STR e eletroforese capilar. Eles afirmam que seus métodos podem ser usados para confirmar a identidade de amostras de sangue coletadas remotamente em Dispositivos de Microamostragem Mitra®.
O advento do perfil genético
Em 1984, Sir Alec Jeffreys, pioneiro em genética na Universidade de Leicester, Reino Unido, inventou a técnica de perfilamento genético conhecida como “impressão digital genética”. O perfil genético foi usado pela primeira vez em 1988 para exonerar o suspeito Richard Buckland e condenar Colin Pitchfork pelo assassinato de dois adolescentes em Leicestershire, Reino Unido.
Esta técnica é agora uma ferramenta chave usada na investigação forense de crimes, bem como em muitos outros campos, como o teste de paternidade. A técnica também é uma ferramenta importante usada no diagnóstico do câncer e na biologia celular para qualificar as linhagens de células germinativas de controle.
Embora haja 99,9% de homologia no DNA humano, dentro dos 0,1% restantes, existem diferenças distintas entre os indivíduos, que compõem as características específicas de cada pessoa. A única exceção a isso é quando comparamos o DNA de gêmeos idênticos, onde o DNA entre eles é quase idêntico. A impressão digital de DNA examina regiões específicas altamente variáveis do DNA, chamadas de número variável de repetições em tandem ou VNTRs, que diferem de um indivíduo para outro.
Os VNTRs são sequências de base no DNA que se repetem uma atrás da outra. Embora os indivíduos tenham as mesmas sequências de bases repetidas, o número de sequências difere, e é essa diferença no número de repetições que o perfil genético explora (ver Figura 1). Uma variante de VNTRs é chamada de repetições curtas no mesmo sentido que, como o nome indica, são VNTRS com sequências
de base mais curtas.
Como funciona o perfil genético?
Embora haja 99,9% de homologia no DNA humano, dentro dos 0,1% restantes, existem diferenças distintas entre os indivíduos, que compõem as características específicas de cada pessoa. A única exceção a isso é quando comparamos o DNA de gêmeos idênticos, onde o DNA entre eles é quase idêntico. A impressão digital de DNA examina regiões específicas altamente variáveis do DNA, chamadas de número variável de repetições em tandem ou VNTRs, que diferem de um indivíduo para outro.
Os VNTRs são sequências de base no DNA que se repetem uma atrás da outra. Embora os indivíduos tenham as mesmas sequências de bases repetidas, o número de sequências difere, e é essa diferença no número de repetições que o perfil genético explora (ver Figura 1). Uma variante de VNTRs é chamada de repetições curtas no mesmo sentido que, como o nome indica, são VNTRS com sequências de base mais curtas.
Figura 1. Uma diferença no número de repetições curtas em tandem (um tipo de VTNR) entre sujeitos individuais.
Existem várias etapas no processamento de amostras para perfil genético, a primeira das quais é extrair DNA intacto da amostra. Há uma variedade de maneiras de se fazer isso, incluindo extração orgânica e SPE. Em seguida, a amostra é medida quantitativamente para a quantidade de DNA que contém. Depois disso, a amostra é amplificada usando a reação em cadeia da polimerase (PCR), onde iniciadores específicos para VNTRs conhecidos (ou para repetições curtas em tandem conhecidas {STRs}) são empregados e amplificados usando termociclagem. Finalmente, os amplicons são separados por eletroforese. Isso fornece o padrão clássico de ‘código de barras’ em um gel eletroforético, onde cada barra é um número de repetição em tandem específico para um local específico no DNA.
Perfil genético de microamostras para identificação de amostras
Desde a pandemia de COVID-19, houve uma mudança notável no projeto de ensaios clínicos, de ensaios tradicionais no local/clínica para ensaios clínicos remotos ou descentralizados. Também vimos uma transição para uma mistura de ambos, chamada de design de “teste híbrido”. Existem vários benefícios para essa transição remota, longe dos testes clínicos in loco. O primeiro benefício é reduzir a carga de viagens para os pacientes, em que eles não têm o inconveniente de fazer viagens frequentes à clínica para consultas relacionadas ao estudo. Um segundo grande benefício é a redução significativa nos custos que os testes remotos oferecem. Foi relatado que os ensaios clínicos custam uma média de US $ 41.117 por paciente e US $ 3.562 por visita do paciente ao local do estudo.
Para ajudar a custear esses custos de teste, muitas organizações nos últimos anos realizaram testes clínicos descentralizados, oferecendo aos seus voluntários opções de amostragem remota de matriz seca usando ferramentas caseiras, como o Dispositivo Mitra®. Por exemplo, no início da pandemia de COVID-19, um ensaio clínico remoto foi conduzido usando Dispositivos Mitra® para coletar amostras de sangue capilar de profissionais de saúde para ver se a Hidroxicloroquina oferecia alguma proteção profilática contra o SARS-CoV-2. Embora os resultados deste estudo indicassem que a Hidroxicloroquina não oferecia proteção contra o vírus, ela demonstrou a utilidade da amostragem remota durante os confinamentos e restrições da pandemia.
Uma preocupação expressa em relação à amostragem remota é garantir a integridade e a identidade da amostra. A integridade da amostra pode ser resolvida através da realização de testes de robustez apropriados durante as validações analíticas. Estudos mostraram que muitos analitos permanecem estáveis em amostras secas em extremos de temperatura durante o transporte. A identidade da amostra é outra preocupação para aqueles que projetam ensaios remotos, porque querem ter certeza de que uma amostra foi coletada pelo indivíduo correto.
Uma opção para resolver isso é ter amostras coletadas na presença de outra pessoa, como um profissional de saúde – virtualmente por meio de uma vídeo chamada ou pessoalmente por meio de uma unidade móvel que visita a casa do participante. Outra solução é perfilar geneticamente a amostra antes da análise do analito de interesse. Esta abordagem pode ser mais conveniente, e um benefício adicional é que as amostras podem ser enviadas sem rótulos afixados para identificação do paciente, uma vez que o “processo de ID” seria conduzido geneticamente no laboratório.
Identificação de Amostras de Sangue Coletadas Remotamente com Perfil Genético
Recentemente, a Promega Corporation desenvolveu com sucesso um protocolo para a extração de DNA de amostras de sangue seco usando Dispositivos Mitra® com a finalidade pretendida de verificar a identidade de amostras de sangue coletadas remotamente. O protocolo está resumido abaixo.
- Dispositivos Mitra com pontas VAMS (30 µL) foram extraídos em um tampão contendo Proteinase K para remover a Proteína e liberar o DNA celular. Os extratos de amostra foram então purificados usando um Instrumento Maxwell®
- Após a purificação, as amostras foram quantificadas usando um método baseado em corante fluorescente (Sistema QUANTIFLUOR® ONE dsDNA em um Fluorômetro Quantus™) ou um método baseado em amplificação (Ensaio ProNex® DNA QC).
- As amostras foram então amplificadas por PCR usando o Sistema GenePrint® 24, que é projetado para gerar um perfil de DNA humano de múltiplos locais a partir de uma variedade de amostras biológicas derivadas de humanos. Foram utilizados Loci STR Polimórficos (n=22) e dois Loci para determinação do sexo. Os Amplicons foram então separados por eletroforese capilar no Spectrum Compact CE System.
- Finalmente, a análise de dados foi realizada empregando o software GeneMapper™ IDX v1.6.
- Os dados foram emparelhados com um protocolo de referência de Swab Bucal Padrão.
Resultados e Conclusões do Estudo Promega
A identidade de amostras de sangue coletadas remotamente em Dispositivos de Microamostragem Mitra® pode ser verificada através do fluxo de trabalho fornecido através de extração de DNA, quantificação de DNA, amplificação de STR e eletroforese capilar.
- Concentrações consistentes de DNA de alta qualidade foram observadas em três microamostras duplicadas de Mitra®.
- As chamadas de Loci e Alelos concordantes foram observadas usando o SistemaGenePrint® 24 para cada Swab Bucal
de referência pareado e microamostra de sangue Mitra®.
Conclusão
O trabalho realizado pela Promega mostrou que amostras de DNA de alta qualidade foram extraídas e analisadas com sucesso para a confirmação e identidade de amostras de sangue. Em termos de estabilidade, sabemos de trabalhos anteriores sobre a detecção do Transgene EPO a partir de extratos de amostras Mitra® que, Alexandre Marchand e outros pesquisadores, demonstraram boa estabilidade nas microamostras por, pelo menos, um mês quando armazenadas em temperatura ambiente.
Uma preocupação expressa em relação ao perfil genético de amostras de sangue é que os dados gerados a partir do teste genético poderiam ser usados de forma inadequada. Por exemplo, os dados podem ser usados para revelar os riscos dos doadores da amostra de desenvolver doenças específicas.
No entanto, o ensaio desenvolvido pela Promega atua apenas como um identificador de amostra, identificando o sexo do indivíduo e geneticamente “codificando em barras” a amostra para essa pessoa específica. Não investiga outras informações, como quaisquer riscos à saúde, sendo assim os dados não podem ser apropriados indevidamente para outros fins. Portanto, este trabalho se mostra promissor, como uma via segura para a identificação de amostras moleculares que poderia atuar como uma ferramenta para a identidade de amostras anônimas para utilidade em ensaios clínicos remotos ou descentralizados.
Para saber mais sobre o Dispositivo Mitra® e sua aplicabilidade entre em contato com [email protected]